刘在哲,葛磊,季延平,张雨桐,赵涛,亓玉昆,张玉娇,王清海*
红肉苹果炭疽病病原鉴定及其生长适应性研究
刘在哲1,2,葛磊3,季延平2,张雨桐4,赵涛5,亓玉昆2,张玉娇1,王清海2*
1. 济南市林场, 山东 济南 250014 2. 山东省林业科学研究院, 山东 济南 250014 3. 山东省林草种质资源中心, 山东 济南 250102 4. 福建师范大学, 福建 福州 350108 5. 泰安市徂徕山林场, 山东 泰安 271027
为明确红肉苹果的侵染病菌种类及其生长适宜条件，本文采用形态学、致病性以及多基因系统发育分析，并测定其培养基类型、温度、pH、光照适宜生长条件。结果表明：暹罗炭疽菌（）为其侵染病菌；
马铃薯蔗糖培养基（PSA）、沙氏培养基（SDA），25 °C～30 °C,pH 8.0～10.0，持续光照或黑暗交替（12h:12h）等环境条件适宜菌丝生长。
暹罗炭疽菌; 病原鉴定; 生物学
苹果适应性广、营养价值高、耐贮存，是世界性水果之一。据FAO统计，2019年全球苹果结果面积4,717,384 hm2，产量87,236,221 kg，中国苹果结果面积2,041,197 hm2，产量42,426,578 kg，在种植面积和总产量方面位列世界第一。然而，就单位面积产量来看，世界苹果主产国美国、法国、意大利的平均单位面积产量分别为420,468 hg/hm2、348,124 hg/hm2、418,853 hg/hm2，而中国仅为207,851 hg/hm2(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)，单位面积产量远远低于美国、法国、意大利。其中，病虫害危害是重要的原因之一。
苹果在生长季节容易受到多种病害的侵染，严重影响苹果的产量和果实品质，其中由炭疽菌属（sp.）真菌引起的苹果炭疽病（苦腐病、叶枯病）是全球范围内一类最重要的真菌病害，造成严重的经济损失。炭疽菌属真菌是全球分布的一类重要的植物病原真菌，可以侵染多种谷类作物、水果、蔬菜以及观赏植物等寄主，造成严重的经济损失[1-3]。由于其重要的科学及经济价值，炭疽菌属真菌已经成为全球第八类重要的植物病原真菌[4]，对全球农林业生产构成了严重威胁。
目前已知可以侵染苹果的炭疽菌属真菌有(巴西、韩国、美国)[5-8]、（韩国、巴西、美国、日本）[6-11]、（韩国、美国、比利时、法国、斯洛文尼亚）[6,8,12-14]、s.s.（韩国）[6]，（韩国、美国、日本）[6,8,10]、（巴西）[7]（巴西）[7]（巴西）[7](捷克、比利时、新西兰、乌拉圭)[12,15-17]（巴西）[18]（美国）[8]（挪威）[19]（日本）[10]（美国）[20]sp. nov.（美国）[20]（比利时）[12]（比利时）[21]（比利时、英国、斯洛文尼亚）[12,14,21]（乌拉圭）[17]。
苹果炭疽病是中国苹果各产区的一种的重要植物病害。已有的报道表明，在中国引起苹果炭疽病的炭疽菌主要有、、、、、、（中国）[22,23]。
近些年来，随着人们对功能性水果的迫切需求，红肉苹果（）是新疆野苹果的一种变种，原产于中国及哈萨克斯坦。由于其富含花青苷、绿原酸、原儿茶酸、根皮苷等多种保健功能物质以及亮丽的外观品质，作为功能果品，美国、加拿大、日本、中国、新西兰等多个国家的苹果育种专家相继开展了相关的研究。截止目前，已有的3000余份红肉苹果资源或品种（系），均是新疆红肉苹果直接或间接的后代。2015年，山东省种植的红肉苹果，炭疽病发生严重，病果率达到50%以上，严重的园区甚至绝产，严重影响红肉苹果产业的健康发展。因此完全有必要对红肉苹果炭疽病病原进行系统研究，明确其生物特性，为红肉苹果炭疽病的防治提供理论依据。
1.1 供试材料
感病红肉苹果果实，从山东省济南市唐王镇红肉苹果种植园采集。
1.2 方法
1.2.1 红肉苹果炭疽病病组织分离及分离菌单孢培养 采用组织分离法。样品用70%乙醇表面消毒后，利用灭菌的解剖刀在果实病健交界处3～4 mm2的组织块，先用1%次氯酸钠浸泡1 min，然后再用70%乙醇溶液浸泡1 min，最后无菌水冲洗3次。置于PDA平板上，每个平皿放置5块，28 ℃培养5 d，挑取单个菌落菌丝，转移到新的PDA平板上，28 ℃下培养7 d，采取孢子稀释分离法获取单菌落。将单菌落菌株培养后移于斜面试管中，4 ℃保存。所有菌种均保存于山东省林业科学研究院森林保护研究所实验室。
1.2.2 分离菌致病性测定 采用离体接种法。品种为‘玖红苹果’。选择无病无虫伤的苹果果实、叶片，用自来水冲洗干净，晾干后，用75%酒精表面消毒，备用。将供试菌株在PDA培养基上培养5 d，在菌落边缘用打孔器制作菌饼（φ = 5 mm），以空白PDA培养基为对照，用无菌的接种针（φ = 0.5 mm）轻微刺伤果实、叶片，每片叶接种1片菌饼、每个果实接种3片菌饼，每个处理叶和果实各5片（个），试验重复2次。将处理后的果实、叶片置于灭菌的烧杯中，用保鲜膜密闭烧杯，保持一定湿度，置于28℃的恒温培养箱中培养5 d，观察。
1.2.3 病原鉴定
1.2.3.1形态特征观察 （1）菌落形态观察将分离获得的红肉苹果炭疽病菌菌株在PDA培养基平板活化培养5 d，在菌落边缘利用打孔器制作菌饼（φ = 5 mm），将菌饼置于PDA平板中央，每个平板置1块菌饼，28 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培养5 d，观察记录菌落特征。
（2）菌株分生孢子、附着胞及产孢特征显微观察将分离获得菌株接种到PDA平板上，28 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培养5 d，以无菌水为浮载剂，挑取培养基上的小粒点，用盖玻片轻轻压碎，在盖玻片上滴香柏油，封住盖玻片四周，室温下放置24 h，利用Nikon50i显微镜（Nikon Eclipse 50i，日本）观察分生孢子、附着胞、产孢梗以及产孢细胞形态，利用QImaging 照相系统（QImaging加拿大）拍照，利用cellSens软件测量分生孢子、附着胞大小。
1.2.3.2菌株DNA提取及保守基因序列的扩增与测序分析DNA提取采用改进的CTAB法[24]。选择的目的基因分别为核糖体转录间隔区序列（ITS）、肌动蛋白基因（）、几丁质合成酶A基因（）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（）、β-微管蛋白基因（）和钙调蛋白基因（）进行扩增与测序。试验所用引物见表1，反应体系：25 μL，包括Taq酶mix 12.5 μL，上游引物下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板2 μL。PCR产物由上海派森诺生物科技有限公司进行双向测序。
将各个菌株的ITS、、、、和基因序列提交到GenBank数据库中，基因编号见表2。将获得的各个序列在Q-bank（www.q-bank.eu）数据库中进行比对。选取44株菌株，其中（MAFF 305972）作为外围菌株。利用MEGA 7.0中的Clustal W对各基因序列进行比对，将校正后的各基因利用Fasta alignment joiner软件（http://users-birc.au.dk/biopv/php/fabox/alignment_joiner.php#）以首尾相连的方法合并（--1--ITS--），利用MEGA7.0软件采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建多基因系统发育树，以自展法（Bootstrap）进行检测，共循环1000次。
1.2.4 红肉苹果炭疽病菌生长适应性测定分别设置不同培养基（PDA培养基、PMA培养基、玉米粉琼脂培养基CMA、PSA培养基、燕麦片培养基OA、沙氏培养基SDA和马丁氏培养基Martin）、不同温度（5 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、不同pH（5、6、7、8、9、10）、不同光照条件（12 h日光灯交替照射、日光灯24 h持续照射、连续黑暗）等处理，接种生长一致的红肉苹果炭疽病菌菌饼（φ = 9 mm），28 ℃培养5 d，采用十字交叉法测量菌落直径。每个试验处理重复3次，平行测定4次。
表1 PCR扩增所用引物及反应程序
表2 用于系统发育分析的参考菌株序列
粗体表示的是模式菌株，*表示的是研究菌株 Ex-type strains or authentic cultures are in bold. * Strains collected in this study
1.2.5 数据处理与分析利用Spss 20.0软件进行数据处理，差异显著性分析采用Duncan多重比较法。
2.1 红肉苹果炭疽病症状
主要危害果实，发病初期，病斑圆形、浅褐色、边缘清晰，斑点周围有时会有红色圆圈。后病斑逐渐扩大，病斑中央凹陷，产生轮纹状排列的黑色小粒点（分生孢子盘），在分生孢子盘上产生粉红色或橘红色粘性物质（分生孢子）。病害后期，病斑扩大至半个果面（图1），造成果实早落，或在挂在树枝上成为僵果。
图1 红肉苹果炭疽病田间症状
2.2 分离菌株致病性
接种分离菌菌饼的果实和叶片，5 d后均表现出炭疽病症状（图2），发病率为100％，对照未表现出症状。果实上病斑圆形或近圆形，中央凹陷，黑色小粒点轮纹状排列，产生橘红色粘质孢子堆（图2a）。叶片上病斑扩展受叶脉限制，病部有小黑点产生，溢出橘红色粘质孢子堆（图2b）。症状均与田间红肉苹果植株发病症状一致，并且从接种的果实、叶片的病斑上分离到的菌株与原来接种菌株形态特征一致。表明，分离到的菌株为红肉苹果炭疽病的病原菌。
图2 致病性试验
(a)果实接种后病斑 Necrotic lesion on red-fleshed apple fruits; (b) 叶片接种后病斑 Necrotic lesion on red-fleshed apple leaves
2.3 红肉苹果炭疽病菌形态特征
在PDA培养基上最初为白色，随后在接种点附近产生分生孢子盘及橘红色分生孢子堆。气生菌丝白色，棉絮状，浓密（图3a）。分生孢子盘黑色或者褐色，圆形或不规则图形，无刚毛。分生孢子梗透明、有隔膜、无分枝（图3b）。分生孢子为单细胞、无色、光滑、圆柱形或椭圆形（图3d），大小为16.7±1.5×6.1±0.9 μm，=50，长宽比为2.9。附着胞侧生或顶生，卵圆形或椭圆形（图3c），大小为9.2±1.6×8.0±1.8 μm (=20)。菌株形态特征、培养性状符合复合种的特征描述。
图3 红肉苹果炭疽病菌形态特征
(a) 菌落形态，(b) 分生孢子盘，分生孢子梗，产孢细胞，(c) 附着胞，(d) 分生孢子
(a) Cultural characters. (b) Acervulus, conidiophores, and conidiogenous cell. (c) Appressoria. (d) Conidia Bars=50 μm
2.4 红肉苹果炭疽病菌多基因序列分析
将获得的11株菌株（JNTW11、JNTW12、JNTW13、JNTW14、JNTW15、JNTW2、JNTW22、JNTW33、JNTW43、JNTW53、JNTW63）与44株对比菌株的ITS、、、、、的基因序列，采用最大似然法（Maximum Likelihood）构建多基因系统发育树（图4）。所有模式菌株以粗体表示，自展率标于节点处，标尺指示为0.02步变化。系统发育树最高对数似然值为-8852.79。本试验获得的11株菌株与聚在一个分支上，自展率为93%，结合分离菌株的形态特征、培养性状，本试验获得菌株为。
2.5 红肉苹果炭疽病菌的生长适应性
2.5.1 不同培养基对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响由图5可以看出，培养基不同，红肉苹果炭疽病菌（菌株JNTW33、JNTW11、JNTW2）菌丝生长状况不同。菌株JNTW11在SDA培养基上生长最好，菌丝生长速率为1.67 ± 0.84 cm/d，在<0.01水平上具有显著性差异。CMA培养基不适宜菌株JNTW11生长，菌丝生长速率仅为0.99 ± 0.09 cm/d。菌株JNTW33和JNTW2最适的培养基为PSA、SDA培养基，在CMA、Martin及OA培养基上生长最差。
图4 利用最大似然法基于红肉苹果炭疽病菌ITS、GAPDH、ACT、CHS-1、TUB2和CAL的基因数据构建的系统发育树
2.5.2 温度对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响图6结果表明，红肉苹果炭疽病菌在温度低于5 ℃或高于35 ℃的环境中受到抑制，生长缓慢。适宜菌株生长的温度为30 ℃。
图5 不同培养基对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响
图6 不同温度对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响
2.5.3 pH对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响适宜红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的pH值范围较广，在pH 5.0 - 10的范围内菌丝均能正常生长。不同菌株对酸碱度的适应性不同，在pH 5.0 - 10之间，pH值对菌株JNTW33、JNTW2菌丝生长无显著性影响；
而对JNTW11菌株菌丝生长具有显著性影响，生长速度在0.01水平上具有显著性差异（图7）。
2.5.4 光照条件对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响图8结果表明，光照对3株红肉苹果炭疽病菌菌丝生长速度的影响趋势一致。与持续黑暗相比，持续光照或12 h交替照射条件下更适宜3株菌株生长，菌丝生长速度在< 0.01水平上具有显著性差异。
图7 不同pH对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响
图8 光照对红肉苹果炭疽病菌菌丝生长的影响
红肉苹果富含有机酸、苹果酸、多酚类物质（绿原酸、原儿茶酸、花青苷、根皮苷等）、三萜类物质等营养物质，能够有效防止人体细胞、组织或器官因氧化应激反应所导致的氧化损伤，具有多种保健功能，因而具有重要的营养价值和药用价值。红肉苹果正处于选育、引种阶段，尚未大面积种植，但在一些种质园，红肉苹果炭疽病发生较重，严重影响红肉苹果的推广利用。为有效控制炭疽病的危害，明确病原种类是十分必要的。
炭疽菌属真菌1790年首次发现，直到1831年Corda才首次建立炭疽菌属。炭疽菌属真菌具有丰富的种群多样性，其形态特征、培养性状、致病力以及遗传变异较大，有些近似种之间差异微小，而且有时会有多种炭疽菌同时存在同一寄主的现象。所以仅仅根据形态学特征、寄主范围以及ITS序列进行鉴定，结果可能并不准确。随着形态学、致病性以及多基因的系统分析等综合方法的应用，一些炭疽菌新种不断被发现，一些原来的种被废弃。本研究利用形态学结合ITS、、、、和等多基因系统发育分析，明确了引起红肉苹果炭疽病的病原菌为暹罗炭疽菌（）。
目前，苹果属下已接受的种62个。已有的文献报道炭疽菌危害的有，，，和。危害的炭疽菌有,,,,,,,,,,,[9,12,16,21]；
危害的炭疽菌有，,,,,,[12,17,25,26]；
危害的炭疽菌有[27]；
危害的炭疽菌有s.l.[28]；
危害的炭疽菌有，[29]。本文是首次发现报道侵染危害。
暹罗炭疽菌在泰国咖啡上首次发现，引起咖啡炭疽病[30]。暹罗炭疽菌寄主和分布范围比较广，在非洲、美洲、大洋洲、亚洲均有分布[31-34]。最新的研究报道，暹罗炭疽菌可以侵染危害番木瓜、圆形薯蓣、subsp.、草莓、杧果、刺果番荔枝、葡萄、桃、越桔、聚果榕、台湾青枣、柑橘、油茶、黄麻、樟树、蜘蛛兰、兰科植物、杨桃、毛白杨、草珊瑚、核桃、油桐、香港四照花、德保苏铁、金茶花、滴水观音、茉莉花、椰子、黛粉叶、桂花、番石榴、紫荆花、洋葱、印楝、石榴、红蝉花、菠萝蜜、枇杷、无花果、薄荷、鳄梨、胡椒、开心果、迷迭香、可可等多种植物。本研究首次发现暹罗炭疽菌侵染红肉苹果引起炭疽病，红肉苹果是其新寄主。目前，对暹罗炭疽菌的研究仅限于种名的鉴定，有关生物学、生态学、流行学、种群遗传结构和有效的防治措施有待进一步研究。
弄清红肉苹果炭疽病菌的生物学特性是研究该病的重要基础。本试验选取了3个代表性菌株（JNTW11、JNTW2以及JNTW33）进行了生长适应性研究。在不同培养基上3株菌生长速率略有不同。适宜的培养基为SDA培养基、PSA培养基，适宜的温度为25～30 ℃。菌株在pH 5.0～10.0范围内能够正常生长，适应的pH值范围较广。不同菌株对酸碱度的适应性不同，JNTW33和JNTW2菌株在pH 5.0～10.0之间菌丝生长速率在0.01水平上无显著性差异，pH值对JNTW11菌株的菌丝生长影响较大，不同pH值下的菌落直径在<0.01水平上具有显著性差异，其中弱碱性环境更适宜菌丝生长。光照条件对3株菌株菌丝生长速率的影响具有一致性，黑暗条件不利于菌丝生长。病害的发生程度与菌株生物学特性密切相关。光照有利于菌丝生长，是否有更利于发病，还需要林间进一步调查研究。本研究结果明确了红肉苹果炭疽病的病原种类，弄清了其生长适应性，研究结果为预测病害发生和有效控制提供了基础的理论依据。
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Identification and Characterization offrom Anthracnose Disease of Red-fleshed Apple and Adapation
LIU Zai-zhe1,2, GE Lei3, JI Yan-ping2, ZHANG Yu-tong4, ZHAO Tao5, QI Yu-kun2, ZHANG Yu-jiao1, WANG Qing-hai2*
1.250014,2.250014,3.250102,4.350108,5.271027,
Red-fleshed apple anthracnose is a disastrous disease caused bysp. occurred in red-fleshed apple orchards and germplasm gardens, and result in yield losses. So far, the pathogen and its characterization was largely unknown. It is necessary to identify accurately and characterize the pathogen responsible for red-fleshed apple in order to provide further information on effective means of controlling the disease. To verify the etiology of anthracnose on red-fleshed apple using multilocus phylogenetic analyses and morphological characteristics. To determine the effect of culture medium, temperature, pH, and light condition on hyphal growth rate using growth rate method. The results showed that 11 similar single-sporeisolates were obtained from the diseased fruits, and all single-spore isolates could cause the similar anthracnose symptoms. The pathogen of red-fleshed apple anthracnose was identified asbased on six-gene phylogenetic analyses (ribosomal DNA-ITS,,,,, and) and morphological as well as cultural characters.JNTW11, JNTW02, and JNTW33 isolates preferred PSA and SDA culture medium. The optimum condition for growth was 25°C to 30°C, pH value 8.0-10.0, and continuous light or alternate light condition. This is the first report ofas a causal agent of anthracnose of red-fleshed apple, andwas the new host plant toin the world.
pathogen identification; biology
S436.65
A
1000-2324(2021)05-0713-10
2021-10-09
2021-10-12
山东省农业重大应用技术创新课题;山东省林业科技创新项目(2019LY003-4)
刘在哲(1969-),男,高级工程师,主要从事林木病理学研究. E-mail:liuzaizhe1969@126.com
通讯作者:Author for correspondence.E-mail:wqhhai@126.com
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