张徐玥, 宋蕴哲, 李悦悦, 聂传朋, 李焰焰, 蔡普默
(武夷学院茶与食品学院，福建 武夷山 354300)
竹芋科(Marantaceae)植物原产于美洲，现已知有27个属约350种，我国常见的有4个属10余种，主要分布于我国南部地区[1]。竹芋科植物除具观赏价值外，其根茎富含淀粉，可直接煮食或加工后食用，还兼具清肺、利水的药用功效，深受人们的喜爱[2]。随着我国引种品种和栽植面积的增加，竹芋病害日趋严重。国内已报道的竹芋病害有近10种[3-4]，主要有炭疽病[5-6]、基腐病[5]、叶斑病[6]等。竹芋病害的发生不仅严重影响其观赏价值，也影响其经济价值。目前,国内对竹芋病害病原菌的分离鉴定及生物防治的研究仍较少。吴碧云[6]研究发现，广州市紫背竹芋(Stromanthesanguinea)炭疽病病原菌为暹罗炭疽菌(Colletotrichumsiamense)；
赵京鹏[7]研究发现，广州市孔雀竹芋(Calatheamakoyana)基腐病病原菌为天南星丽赤壳(Calonectriaspathiphylli)；
陈灿钿等[8]研究发现，平脐蠕孢(Bipolarissivanesaniana)可引起广州市青苹果竹芋(Calathearotundifoliacv.fasciata)的叶斑病。
2021年5月在武夷学院园艺大棚内发现种植的艳锦竹芋(Stromanthesanguinea‘Triostar’ )发生了一种较为严重的病害。根据已有关于紫背竹芋属叶枯病的症状描述[3]，诊断该病害为叶枯病。艳锦竹芋又名三色竹芋、艳锦密花竹芋，是竹芋科紫背竹芋属的多年生草本植物[9]。紫背竹芋属叶枯病初期多从叶尖开始干枯或产生病斑，后逐渐向叶基侵染，后期叶片干枯卷曲并出现黑色粒状物，严重时植株容易出现死亡[3]。目前，引起艳锦竹芋叶枯病的病原菌种类尚不明确。因此，本研究以武夷山市武夷学院园艺大棚内艳锦竹芋叶枯病叶片为试验材料，通过分离病原菌和测定致病性，结合系统发育树的分析，对艳锦竹芋叶枯病的病原菌进行鉴定，旨在为其叶枯病的诊断及防控提供依据。
1.1 病叶采集与病原菌的分离纯化
2021年5月，在福建省武夷学院(118°00′E，27°44′N)园艺大棚内对艳锦竹芋症状进行拍照，并采集病叶作为供试样品。参考方中达[10]的常规组织分离法分离出病叶样品的病原菌并纯化。具体操作为：将病叶样品用无菌水冲洗干净，在超净工作台切取若干块2 mm×2 mm病健交界处的病叶组织，用体积分数为75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，风干后放置在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基中央，28 ℃下恒温培养。7 d后挑取菌落边缘菌丝转接于PDA培养基继续培养，重复3次。纯化后的菌丝块(Φ=5 mm)放在装有无菌水的10 mL离心管中，置于-4 ℃冷冻保存。
1.2 病原菌的致病性测定
采用菌丝块针刺接种法，分别进行离体和活体接种[10]。用75%酒精和无菌水消毒健康叶片后，随机在叶片上穿刺5个小孔，作为接种处；
在菌落边缘切取菌丝块(Φ=5 mm)，将菌丝面贴合接种处，覆盖湿棉球保湿，以无菌PDA培养基块(Φ=5 mm)为对照。离体和活体接种的叶片都用上述方法进行处理，均接种6片叶片，重复3次。接种后的离体叶片基部用湿棉球包裹后置于培养皿内(底部铺有无菌水浸湿的滤纸)，放置于28 ℃恒温培养箱保湿培养。接种后的活体植株套上透明塑料袋隔绝污染，置于光照通风处，按日常方法管理。定期观察发病情况并拍照记录，待产生病斑后再次分离病原菌。
1.3 病原菌的形态学观察
将分离纯化的菌株置于PDA培养基上28 ℃培养7 d，测量菌落直径，观察并记录菌落的形态特征。使用插片法诱导产孢。将有分生孢子的盖玻片制成临时装片，在Nikon相差倒置显微镜[Eclipse Ts2，成贯仪器(上海)有限公司]下观察孢子的大小、形状以及产孢细胞的形状和产孢方式，并拍照。
1.4 病原菌的分子鉴定
将纯化的菌株接种至新PDA培养基中，待菌丝长满培养基，刮取适量菌丝体，采用液氮研磨样本。使用真菌基因组DNA抽取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取纯化菌株的DNA，-20 ℃下保存。1%琼脂糖检测合格后，选用 ITS1/ITS4引物(TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增。PCR反应体系为：10 μL 2×Taq PCR反应混合物溶液、12 μL ddH2O、2 μL DNA、1 μL上游引物和1 μL下游引物。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；
72 ℃总延伸7 min，16 ℃保存。扩增后PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后进行DNA测序，由上海派森诺生物科技有限公司完成。将测序结果与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，运用MEGA11软件，根据邻位归并法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树。
2.1 叶枯病症状及病原菌分离纯化结果
患病艳锦竹芋的病害特征主要集中在叶片(图1)。从图1A、1B可见，叶片边缘有不规则黄褐色的病斑，病健交界处有明显失绿变黄的晕圈。病原菌多从叶尖和叶缘侵入，形成病斑并沿叶柄蔓延，与相邻病斑相接形成大病斑，病斑处干枯起皱伴随卷曲。随着病斑扩大，导致叶片大面积干枯坏死后脱落。叶片正反面(图1C、1D)散生大小不等的黑褐色近圆锥形粒状凸起，多以叶片正面为主，牢牢附着在叶片上，中心为浅褐色。本研究从艳锦竹芋病叶上分离纯化得到2株菌落形态不同的单菌株。
A、B为患病植株;C、D为病斑明显的病叶正、反面。
2.2 叶枯病病原菌的致病性测定结果
将分离纯化得到的2株菌株分别进行致病性测定表明，仅菌株YJ-1有致病性，且发病情况与病叶样品边缘病斑相符。YJ-1离体接种叶片在接种后第5天开始发病，活体接种叶片在接种后第7天开始发病，离体接种病斑比活体接种病斑扩展速度更快、范围更广，发病更严重。接种初期在接种处开始褪绿发黄，病斑迅速向四周大面积扩散，无明显分界，可扩大到整个叶片，背部出现不规则锈斑(图2)。离体接种和活体接种均未出现黑褐色凸起小颗粒。从接种发病的叶片上分离到的菌株形态学特征与接种菌株YJ-1一致，经柯赫氏法则证实YJ-1为艳锦竹芋叶枯病的病原菌。
A、B为离体接种10 d(正、反面);C、D为离体接种15 d(正、反面);E、F为活体接种15 d(正、反面)。
2.3 叶枯病病原菌的形态学观察
在PDA培养基上28 ℃培养7 d后，菌株 YJ-1的菌落直径约75 mm，呈致密的蛛网状白色圆形，中央隆起，气生菌丝发达，背面出现黄棕色色素(图3A、3B)；
后期菌落平滑，气生菌丝呈白色卷曲，集结成圆环状，背面色素颜色变为红棕色(图3C、3D)；
有芳香气味。菌丝有隔(图3E)；
分生孢子梗分枝少且明显，产孢细胞瓶梗单生或2～3个轮生(图3G)；
大分生孢子纺锤形，较直，顶胞稍显钝圆，最宽部位在中部以上，3～5隔，分隔不明显；
小分生孢子多为卵圆形或椭圆形，一端稍尖，数量较多，分隔不明显(图3F)；
厚垣孢子球形或椭圆形，壁厚，多单生，少见对生或串生，表面光滑(图3H)。根据形态学观察，初步鉴定为镰孢菌属菌(Fusariumsp.)。
A、B为培养7 d的菌落正、反面;C、D为培养10 d的菌落正、反面;E.为菌丝(400×);F-α.大分生孢子(400×)，F-β.小分生孢子(400×);G.分生孢子梗(400×);H.厚垣孢子(400×)。
2.4 叶枯病病原菌的分子鉴定
菌株YJ-1的ITS测序结果显示，其序列长度为561 bp。将该序列与NCBI核酸数据库中的数据进行Blast比对表明，菌株YJ-1(登录号为ON899813)和NCBI数据库中芬芳镰孢菌(F.redolens，登录号MT563395.1)的相似性达99.82%。系统发育树结果显示，菌株YJ-1与F.redolens聚为一支，置信值为91%(图4)，表明亲缘关系比较近。结合形态学观察，将菌株YJ-1鉴定为芬芳镰孢菌(F.redolens)。
图4 基于ITS序列构建的菌株YJ-1与相关菌株的系统发育树
本试验对引起武夷学院园艺大棚内艳锦竹芋患叶枯病的病原菌进行了分离与鉴定，通过形态学观察和分子鉴定，并结合系统发育树的分析，确定分离的菌株YJ-1为芬芳镰孢菌，是该病株艳锦竹芋叶枯病的致病菌。
芬芳镰孢菌属于镰孢菌属美丽组(SectionElegans)，易变且不稳定，种内分化和变异显著[11]。在形态学上，不仅与同在美丽组的尖孢镰孢菌(F.oxysporum)很相似，也与茄病镰孢菌(F.solani)很相似[12]，所以在不同分类系统中有不同的分类地位[13]。1971年，Booth[14]认为其是尖孢镰孢菌的变种；
2001年，Baayen et al[15]证明了芬芳镰孢菌与F.oxysporum为不同种；
2006年，Leslie et al[16]将其定义为种。该菌普遍存在于温暖地区的土壤中，多为土传病害，主要危害植物的根或茎，少有危害植物的叶。据报道，此菌可引起大豆、马铃薯、小麦等植物的枯萎病[17-19]。目前尚未见芬芳镰孢菌侵染竹芋科植物的报道。芬芳镰孢菌是否还可侵染其他竹芋品种，引起竹芋发病的症状是否一致，有待进一步研究。
本研究仅对艳锦竹芋叶枯病的致病菌进行分离和初步鉴定，建议今后深入开展发病规律、致病机理、病原菌与宿主之间关系等研究，并对鉴定的致病菌进行生防制剂的筛选，以期为竹芋科观叶植物的病害防治提供参考。
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