李 展，张爱琼，罗师红
(毕节市动物疫病预防控制中心，贵州 毕节 551700)
布鲁氏菌病是由布鲁氏杆菌引起的人畜共患慢性传染病。多种动物对本病均有易感性，其中以牛、羊最为常见。其临床特点是引起动物不孕、流产、睾丸炎及关节炎等症状。怀孕母牛常见为产死胎、弱胎或常于妊娠6～8个月发生流产、出现胎衣滞留及子宫内膜炎等症状；
公牛主要表现为睾丸和副睾炎等。
人一般通过接触患病动物的羊水、胎衣或受污染的动物产品而感染，主要传播途径为皮肤黏膜、消化道和呼吸道等。全球每年发病人数超过50万[1]，临床症状主要以出现乏力、波浪热、出汗、关节疼痛及睾丸炎等，也可因布鲁氏杆菌损害到相应的脏器，而出现相应的症状。该病严重影响着养殖业的健康发展及从业人员的身心健康。
布病的实验室诊断方法主要包括分子生物学方法、血清学方法及细菌培养等。分子生物学的方法因为需要专业仪器，试剂成本比较高，不适合在养殖场推广；
细菌培养法比较复杂，且检出率也不高，不适合早期快速诊断。因此，布病临床上的诊断方法以血清学为主。布鲁氏杆菌侵入机体后不断刺激机体产生抗体，因此检测血清抗体对诊断病情具有重要意义[2]。
目前有多种血清学检测方法，主要有虎红平板凝集试验(Rose Bengal Plate Test，RBT) 、竞争酶联免疫吸附试验(Competitive Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，cELISA) 、试管凝集试验(Serun Agglutination Test，SAT) 、 胶体金(GICA) 、补体结合试验(CFT)等。就129份牛血清样本，采用 RBT、SAT以及cELISA 3种实验方法对血清样本进行检测，并对检测结果进行比较分析，旨在讨论不同的检测方法在实际工作中的应用。
1.1 材料来源
牛血清样本来源于XX牛场，该牛购自于Y省，购入后未免疫布病疫苗。
1.2 试剂
检测所用的虎红平板凝集抗原、试管凝集抗原和阳性血清试剂盒购置于哈尔滨维科生物技术有限公司，布鲁氏菌cELISA抗体检测试剂盒由武汉科前生物技术股份有限公司生产，试剂批号均在有效期范围内。
1.3 方法
1.3.1 RBT试验
在生物安全柜内，在干燥洁净的布病检测纸板上用移液器加30 μL 的待检血清，然后取等同量30 μL 的虎红平板抗原充分混匀，4 min内观察结果。并以阳性作为对照，出现+以上反应者判为阳性。判定标准如下。
++++：出现大的凝集片或颗粒，液体完全透明。
+++：有明显的凝集颗粒，液体几乎完全透明。
++：有较明显的凝集颗粒，液体稍透明。
+：稍能见到凝集，液体混浊。
—：无凝集，液体均匀混浊。
1.3.2 SAT试验
为每一份待检血清各准备4只试管，第1管加入960 μL的生理盐水，第2到第4管各加500 μL的生理盐水，在第1管中加入40 μL的待检血清，充分混匀吸取500 μL加入第2管，并充分混匀。如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去500 μL混匀液。稀释完毕，从第1到第4管的血清稀释度分别为1:25、1:50、 1:100、1:200，按操作说明将稀释好的抗原液500 μL分别加入已稀释好的各管血清中，血清稀释度则依次变为1:50、1:100、 1:200、1:400，按照实验操作说明依次配比好阳性对照、阴性对照、抗原对照及比浊管。将加样好的试管置于(37℃±1℃)温箱中孵育18～24 h，检查结果。判定标准：凝集反应程度根据参照比浊管来判读，分别记为“++++”“+++”“++”“+”“—”，按以下说明判定。
++++：菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮。
+++：菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮。
++：菌体凝集显著，上层液体50%清亮。
+：有凝集物沉淀，液体25%清亮。
—：无凝集物，液体均匀混浊。
实验成立条件及结果：当阳性对照血清出现完全凝集(++++)，阴性对照血清无凝集(—)，抗原对照无自凝(—)现象时，实验成立。对结果做如下判定，1:100血清稀释度出现“++”及以上凝集现象时，判为阳性。1:50血清稀释度出现“++”及以上凝集现象时，判为可疑。实验结果可疑的经30 d后，重检，如果仍为可疑，判为阳性。
1.3.3 cELISA试验
实验操作步骤按照试剂盒说明进行操作。
成立条件：各对照的测定值在如下的范围内时，试验有效。
无血清空白对照OD450nm0.75～2.0，阳性对照抑制率(PI)80%～100%，阴性对照抑制率(PI)-15%～15%。
判定标准：
计算样品抑制率。抑制率(PI)=(空白对照OD450 nm-检测样品OD450 nm)/空白对照OD450 nm×100%，抑制率(PI)≥30%判为阳性，抑制率(PI)≤30%判为阴性。
采用3种检测方法对129份牛血清样本进行检测，结果如表1所示。
1)采用cElisa实验方法检测出46份阳性样品，其余83份为阴性。
2)采用RBT实验方法初筛检测出20份阳性样品，其中17份包含在用cElisa实验方法检测出的46份阳性样品中，3份未包含在用cElisa实验方法检测出的46份阳性样品中。其余109份为阴性。
3)对经RBT实验方法初筛检测出20份阳性样品，经第一次SAT实验方法检测出阳性样品7份，疑似样品6份，共计13份。第二次对疑似的6份样品1个月后采样复检为阴性，最终为阳性样品7份。其余经SAT实验方法检测结果为阴性的7份样品中4份均包含在经cElisa实验方法检测出的46份阳性样品中和经RBT实验方法初筛检测出20份阳性样品中，其余3份为用虎红平板初筛为阳性，但用cElisa试验方法和试管凝集方法均检测结果为阴性。
4)RBT实验方法与cElisa实验方法检测结果阳性符合率为37%(17/46)；
SAT实验方法与RBT实验方法检测结果阳性符合率为35%(7/20)；
SAT实验方法与cElisa实验方法检测结果阳性符合率为16.3%(7/43)。
表1 牛布病3种检测方法结果
该牛场牛只自从Y省购入后未免疫过布病疫苗，从检测结果来看，该牛场的牛正在感染布鲁氏菌或曾经感染过布鲁氏菌。通过对3种检测方法的检测结果对比，cELISA实验方法的阳性检出率最高，RBT实验方法的阳性检出率次之，SAT实验方法的阳性检出率最低。虎红平板凝集试验(RBT)，该试剂为酸性环境，酸性环境可以抑制血清中的IgM类抗体活性，因此RBT主要是检测血清中的IgG类抗体，但不排除存在未被抑制完的IgM类抗体[3]。
试管凝集试验(SAT)可以根据抗原、抗体是否发生凝集以及凝集程度来定量检测布病的抗体滴度[3]，是目前我国规定的布病确诊检测方法及处置方法，主要是检测血清中的IgM类抗体，根据感染的时间长短也可以检测到少部分的IgG类抗体。竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)，该实验方法测定的抗体比较全面，主要检测IgM类抗体和IgG类抗体。IgM类抗体为感染后最先产生的抗体类型，产生早、持续时间短；
IgG类抗体的产生时间晚于IgM类抗体，且持续时间长。
3种实验方法检测的优缺点为：①虎红平板凝集试验(RBT)操作简便、耗时短、结果判断简单，但有时会产生假阳性结果。抗原抗体反应时间超过4 min会出现纤维素的凝集块；
样品严重溶血；
人为肉眼判断，难免会出现偏差，3种原因均可导致出现假阳性结果。②试管凝集试验( SAT) 特异度高，但是此实验耗时长，操作繁琐，其对于感染初期的布病检测具有重要意义，为我国规定的布病确诊检测方法及处置方法[4]。③竞争酶联免疫吸附试验(cELISA) ，该实验测定的抗体比较全面，IgG类抗体和IgM类抗体都在其检测范围内，此实验的敏感性高，但成本代价大、操作繁琐、特异性差。
实验中3种检测方法检出的阳性率不尽相同，主要原因如下：①3种实验方法所检测的抗体类型不同。②RBT实验方法易受人为肉眼判断、观察结果时间及样品溶血的影响而出现假阳性。③受实验本身的影响，做为布病初筛的RBT实验方法本身的检测结果就要差于用于布病确诊的SAT实验方法。④RBT初筛检测出3份阳性样品未包含在用cElisa实验方法检测出的46份阳性样品中以及用SAT方法检测出的7份阳性样品中，可能是受试剂本身、人为操作以及肉眼判断的影响。⑤受试剂原因、人为因素、实验操作等某些客观原因的影响。
针对上述3种检测方法在布病检测中的结果比较及原因分析可知，虎红平板凝集试验(RBT)主要用于疑似有布病发生时的全覆盖大规模的初筛；
试管凝集试验(SAT)主要用于布病的确诊及规范处置的依据；
竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)可以为布病的流行病学调查及养殖场布病的净化提供一定的基础数据和科学依据。由于试剂原因、人为操作以及实验本身的局限性，在进行布病流行病学调查、诊断、处置、防控等工作中应综合多种实验方法、重复实验操作、认真分析实验结果，并根据《中华人民共和国国家标准GB/T18646-2018》《布鲁氏菌病防治技术规范》提出最佳的防控措施、防控建议和处置方法。